1601年，莎士比亚创作了其最有代表性的悲剧《哈姆雷特》。当时正处在资产阶级革命前夜，伊丽莎白女王统治末年。圈地运动仍在农村进行，城市平民生活愈来愈艰难，资产阶级、新贵族与王室间的联盟渐趋瓦解，英国社会的各种矛盾冲突日益尖锐。12世纪末莎克索·格拉马提卡斯编的《丹麦史》最早记载了哈姆雷特的故事。16世纪末，英国作家以复仇为主题将它编为戏剧，一时极为流行。
莎士比亚把它重新改编，把一段中世纪的复仇故事，改写成一部深刻反映时代潮流、饱含强烈的反封建思想、具有鲜明热烈的人文主义精神的悲剧故事。
《哈姆雷特》的基本剧情如下。
丹麦王子哈姆雷特在德国威登堡大学接受教育，因父王突然死去，他返回丹麦。他的叔父克劳狄斯继承了王位，不久，母后同新王结了婚。老王的鬼魂告诉哈姆雷特，他是被克劳狄斯毒死的，哈姆雷特决定复仇——这不仅是他个人的问题，而是整个社会、国家的问题。为了掩饰自己，他开始装疯卖傻。克劳狄斯中途怀疑他已知悉内情，利用他的两个老同学和他的情人去试探他。哈姆雷特则通过改编一出谋杀兄长的戏剧《贡札古之死》在宫中演出，试探他的叔父，克劳狄斯中途仓皇退席。宫内大臣波洛涅斯即哈姆雷特的情人奥菲利娅的父亲向新王献计，去帷幕后偷听母后同王子的谈话，哈姆雷特以为是新王，一剑将他刺死。克劳狄斯派哈姆雷特和他的两个同学去英国索讨贡赋，想请英王杀死哈姆雷特。哈姆雷特发现阴谋，调换密信，脱险归来。归来后才知道奥菲利娅因为父亲被他杀死、他又远走他国而发疯，已落水而死。克劳狄斯挑拨波洛涅斯之子雷欧提斯同哈姆雷特比剑，并置下毒剑、毒酒两道杀机。结果，哈姆雷特、雷欧提斯都中了毒剑，王后饮了毒酒，克劳狄斯亦被刺死。哈姆雷特临死前嘱托他的好友霍拉旭传达他的心愿。
哈姆雷特对“人”抱有美好的看法，对友谊、对爱情、对政权、对国家都有一整套人文主义的观点，然而他的理想遭到残酷现实的嘲讽：叔父克劳狄斯弑兄自立，还娶了他的母后，他的同学和情人则成了克劳狄斯的帮凶，他最后也中毒剑而死。这是人文主义者的悲剧。哈姆雷特的死，向观众呈现了人文主义者奋斗的悲壮历程。
剧本中的其他人物也都是很有个性的，作者在刻画他们时注意描绘其心理的复杂活动。克劳狄斯是个凶残狠毒的专制统治者，然而他的“脸上堆着笑”，对人很是和气；波洛涅斯昏庸老朽，自以为是；奥菲利娅天真柔弱，她既真心爱恋哈姆雷特，又甘愿做父亲的工具，去试探心上人，她的死是宫廷阴谋斗争的结果。
莎士比亚戏剧的语言极富个性化。在这部剧作中，不同人物在不同处境下使用的语言都不相同，文雅与粗俗、哲理与抒情、嘲讽与深挚，都各适其人、恰如其分。
《哈姆雷特》在世界文学史上的地位是崇高的，它的成就是辉煌的。几百年来，它以鲜明热烈的人文主义思想广传世界各地，它作为一部富有激情与思辨力的悲剧感动着一代又一代读者。莎士比亚的戏剧在中国也同样深受欢迎，一代名家朱生豪先生以毕生精力翻译了莎士比亚大部分戏剧。